Allgemeines

Jede Zelle enthält einen detaillierten Bauplan der Erbinformationen in Form eines DNA-Doppelstrangs (quasi das Buch des Lebens). Die DNA wiederum ist aus 4 verschiedenen Bausteinen, den Nukleotid-Basen (A, T, G und C) in variabler Reihenfolge zusammengesetzt. Dieser für jeden Menschen spezifische Bauplan (Genetischer Code) wird benötigt, um u.a. Proteine (Eiweiße) herstellen zu können, die jede Zelle zum Funktionieren benötigt.

Veränderungen (Mutationen) in der DNA können daher zu einer Veränderung auf Proteinebene führen. Für Mutationen und daraus folgende Veränderungen der Zelle oder des gesamten Organismus ist bekannt, dass diese zu bestimmten Krankheiten wie zum Beispiel Krebs führen können.

Wenn man die zugrundeliegenden Mutationen einer Krebserkrankung identifiziert, lassen sich dadurch für individuelle Patienten spezifische Krebstherapien ermitteln (personalisierte Medizin). Eine Möglichkeit hierfür bietet der PCDx Test. Dieses Diagnostikum kombiniert die Sequenzierung (Next Generation Sequencing) mit der Immunhistochemie. Next Generation Sequencing ist eine Methode um die genaue Abfolge der Basen in der DNA zu ermitteln. Dadurch können Abweichungen zu normaler DNA (Mutationen) festgestellt werden. Anhand der gefundenen Veränderungen auf DNA- und Protein-Ebene können Rückschlüsse auf die Wirksamkeit von Medikamenten gezogen werden.


Next Generation Sequencing - Grundlegendes Prinzip

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein Überbegriff einer Methoden-Klasse, die im Vergleich zu älteren Verfahren schneller die Abfolge der Nukleotide in der DNA entschlüsseln kann. NGS basiert auf der Grundlage eines zellulären Mechanismus, der die zelluläre DNA verdoppelt. Im Körper müssen sich Zellen konstant teilen, um neue erzeugen zu können. Hierfür muss auch die DNA verdoppelt werden. Das Verdoppeln geschieht durch das Aufsplitten des Doppelstrangs. Die sich im Doppelstrang gegenüberliegenden Basen der beiden Stränge sind komplementär. Das bedeutet, wenn man die Basenabfolge des einen Stranges kennt, kennt man auch die Basenabfolge des anderen Stranges. Daher kann ein Strang als Vorlage dienen, um wieder einen Doppelstrang zu synthetisieren.

Dieser Prozess der DNA-Vervielfältigung lässt sich auch im Reagenzglas nachstellen. Die Next Generation Sequencing Methoden nutzen dieses Verfahren und detektieren während des Prozesses genau welche der 4 möglichen Basen eingebaut wurde. Verschiedene Firmen bieten unterschiedliche Verfahren an, die alle auf dem Detektieren von Basen-Einbauten im Hochdurchsatz-Verfahren bestehen. Für die Schnelligkeit müssen kurze DNA Fragmente massiv parallel sequenziert werden können. Hierfür gibt es verschiedene Systeme. Eine häufig verwendete Sequenzierungs-Methode stammt von der Firma Illumina.


Illumina Sequenzierung

Die Illumina Sequenzierung ist eine beliebte Art der Next Generation Sequencing Methoden. Hierbei wird der Einbau der unterschiedlichen Basen über Fluoreszenzsignale gemessen. Um dieses System als ein Hochdurchsatz Verfahren verwenden zu können, muss die zu sequenzierende DNA zerkleinert werden und diese auf einer Flusszelle fixiert werden. Dies macht es möglich die jeweilige Bruchsequenz parallel auszulesen. Hierfür wurde ein vierstufiger Prozess entwickelt.

1. Erzeugung der DNA – Bibliothek

Die zu sequenzierende DNA wird mit Hilfe von Ultraschall in zufällige Bruchstücke zerkleinert. Um die Bruchstücke sequenzieren zu können, müssen diese auf einer Oberfläche fixiert werden. Hierfür wird jedes Bruchstück an beiden Seiten mit einem Adapter verknüpft. Dieser Adapter ist ein kurzer spezieller DNA-Doppelstrang. Diese derart präparierten DNA – Fragmente werden durch eine sogenannte PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) vervielfältigt. PCR ist eine Methode, welche die zelluläre DNA im Reagenzglas vervielfältigt.


2. DNA Fixierung und Cluster Generierung

Die vervielfältigten DNA – Doppelstränge werden in Einzelstränge gesplittet und auf eine Flusszelle gegeben. Diese Flusszelle ist mit den beiden Adaptersträngen als Einzelstränge beschichtet. Dies führt dazu dass die präparierten DNA-Einzelstrang-Fragmente an die Oberfläche binden können und dadurch wieder einen doppelsträngigen Adapter bilden. Die Fragmente sind über die gesamte Flusszelle verteilt. Um später den Einbau der Basen spezifisch für jedes Fragment detektieren zu können, werden die Fragmente an ihrem Bindungspunkt mittels PCR kloniert (Erzeugung identische Kopien). Dadurch entstehen Punkte (Cluster), die eine große Menge an der selben Kopie von DNA-Einzellsträngen gebunden haben. Jedes Cluster kann einzeln analysiert werden.


3. Sequenzierung

Für die Sequenzierung selber wird der spezifische Einbau einer komplementären Base durch Fluoreszenz Signale detektiert. Jede Base löst ein spezifisches Lichtsignal beim Einbau auf. Die gesamte Flusszelle wird aufgenommen und jedes Cluster ist ein Lichtpunkt. Die Lichtpunkte können nach ihrer Farbenabfolge analysiert werden und spiegeln damit die Sequenzabfolge des entsprechenden DNA Fragments wieder.


4. Daten Analyse

Das Auslesen der Farbabfolge eines jedes Lichtpunktes und damit der Sequenzabfolge der Fragmente passiert Computer-basiert. Nach der Bestimmung der Fragment-Sequenz müssen die Sequenzen wieder zu der anfänglichen Gesamt-DNA zusammengesetzt werden. Hierfür werden Überlappungen der Fragmente verwendet um diese zur ursprünglichen DNA in ihrer Gesamtlänge zusammen zu setzen. Diese Gesamt-DNA wird mit einer Referenz-DNA verglichen um Veränderung in der Sequenzabfolge feststellen zu können.

Mit dieser Sequenzier - Methode können verschiedene Fragestellungen beantwortet werden.


Verwendung von Next Generation Sequencing beim PCDx Test

Wie schon im Vorfeld erwähnt ist Sequenzierung eine nützliche Methode um Veränderung im Erbgut von Tumorzellen feststellen zu können. Paradigm analysiert hier je nach Krebsart und bekannten Biomarkern verschiedene Veränderungen auf DNA Ebene.

Folgende Veränderungen im Erbgut werden beim PCDx Test mittels Next Generation Sequencing analysiert:

  • Veränderungen der Kopienzahl (Copy Number Variation, CNV)

  • DNA Mutationen, Amplifikationen, Insertionen, Deletionen

  • Genfusionen innerhalb des gesamten Genoms

  • Mikrosatelliteninstabilität (MSI)

  • Tumormutationslast (TMB)


Veränderung der Kopienzahl (Copy Number Variation, CNV)

Unter Copy Number Variation wird die Variation in der Anzahl, in der ein Gen vorliegt, verstanden. Im klassischen Sinne wird unter einem Gen die genetische Grundlage für ein Protein verstanden. Normalerweise liegen für jedes Protein zwei Gene vor, eins wurde von der Mutter das andere vom Vater vererbt. Allerdings wurde in den letzten Jahren festgestellt, dass riesige Bereiche des Genoms aus Wiederholungen bestehen. Diese Wiederholungen können in Bereichen sein, in denen sich kein Gen befindet, allerdings können auch Gene selber in einer anderen Menge als zwei vorliegen oder sogar fehlen. Diese Variationsmöglichkeit in der Anzahl macht es dem Organismus möglich eine weitere Dimension der Einzigartigkeit zu schaffen, allerdings kann ein überzähliges oder reduziertes Vorliegen zu Krankheiten führen. Die Copy Number Variation kann unter anderem durch Next Generation Sequencing festgestellt werden.

Heute existiert einiges an Wissen, das die vorliegende Anzahl eines speziellen Gens mit einer Krankheit, der Wirkung von Medikamenten bzw. deren Ansprechen verbindet. Aus diesem Grund nutzt Paradigm das spezifisches Wissen von Zusammenhängen zwischen CNV und Tumoreigenschaften, um eine ideale Therapieplanung vorzuschlagen.


DNA Mutationen

Die DNA in einem lebenden Organismus ist dauerhaft DNA-schädigenden Stoffen ausgesetzt, wie zum Beispiel UV-Strahlen im Sonnenlicht. Zellen haben dazu einige Mechanismen entwickelt um geschädigte DNA wieder zu reparieren. Allerdings gelingt dies nicht immer und dadurch entstehen Mutationen. Darunter versteht man eine Änderung der Basen-Abfolge in der DNA. Die Basen-Abfolge ist der Code um Proteine neu herzustellen. Ist nun eine Base dauerhaft verändert kann diese zu einem anderen Protein mit einer anderen Funktion führen bzw. zum Verlust seiner Funktion. Dies ist der Hauptgrund für die Entstehung von Krebs. Zum Beispiel kann ein zentrales Zelltod-auslösendes Protein seine Wirkung verlieren und dadurch wird die Zelle auf einmal unsterblich, eines der Hauptcharakteristiken der Tumorzelle.

Allerdings führt nur ein sehr kleiner Anteil von Mutationen zu krankhaften Veränderungen in den Zellen. Viele Mutationen passieren in DNA-Bereichen, die kein Protein kodieren, oder die Mutation führt beim Ablesen des Codes zu keiner Änderung im Bau und Funktionsweise des entstehendes Proteins. Ein riesiges Forschungsfeld beschäftigt sich mit der Frage, welche Mutationen tatsächlich zu der Entstehung von Krebs führen. Dieses Wissen hilft spezifische Therapien zu erschaffen, da unterschiedliche Krebszellen bestimmte Schwachstellen haben, basierend auf ihren zugrundeliegenden Mutationen.

Als Mutation wird nicht nur die Änderung einer einzelnen Base bezeichnet, sondern auch Amplifikationen, Insertionen und Deletionen gehören in die Kategorie Mutation. Bei einer Amplifikation liegt ein bestimmter Abschnitt der DNA vermehrt vor. Insertion bezeichnet den Einbau von zusätzlichen Basen in die DNA. Bei einer Deletion fehlt eine oder sogar mehrere Basen.

Der PCDx Test analysiert den Tumor auf unterschiedliche klinisch validierte Mutationen und trifft dann Aussagen über mögliche Behandlungsoptionen. Um aussagekräftige Empfehlungen für Therapien geben zu können, arbeitet Paradigm unter höchsten qualitätssichernden Auflagen. So wird die Mutationsanalyse nur an Tumorproben durchgeführt und Paradigm konzentiert sich auf Mutationsanlysen, aus denen medikamentöse Behandlungsoptionen resultieren bzw. bei denen durch Klinische Studien bewiesen ist, dass Mutationen entscheidend sind für eine Therapie.


Genfusionen

Unter dem Begriff Genfusion ist die “Verschmelzung“ zweier Gene gemeint, die aus zwei zuvor getrennten Genen entsteht. Dies kann in einer Zelle zufällig bei der Zellteilung passieren. Dadurch entsteht ein neues Protein. Durch die Verschmelzung kann es vorkommen, dass das Gen des Proteins A durch die Verbindung mit einem Stück des Gens für Protein B verbunden wird und dadurch Protein A um ein Vielfaches mehr hergestellt wird. Andere Effekte wären, dass an Protein A ein Stück von Protein B gebaut wird. Diese Fusion kann positiv für die Zelle sein aber in sehr vielen Fällen ist dies negativ. Die Zelle ist ein sehr komplexer Mechanismus der extrem fein abgestimmt sein muss und durch die Veränderung der Proteinmenge, des Proteinvorkommens oder der Funktion können unter anderem Krebszellen entstehen.

1960 wurde zum Beispiel das erste Mal ein Krebstyp mit einem bestimmten Fusionsgen in Verbindung gebracht, das sogenannte Philadelphia Chromosom bei Chronischer myeloische Leukämie (CML). Bei diesem Krebstyp wurden die Proteine Bcl und Abl1 miteinander fusioniert und dadurch entsteht eine Art des Abl1 Proteins mit einer dauerhaften unkontrollierbaren Funktion. Das veränderte Abl1 Protein ist konstant aktiviert und kann nicht mehr durch andere Proteine kontrolliert werden, dadurch teilt sich die Zelle dauerhaft und unkontrollierbar und Krebszellen entstehen.

Durch das Erkennen von Fusionsgenen, die zu Krebszellen führen, können gezielte Therapien verabreicht werden. Im Fall von Chronischer myeloischer Leukämie (CML), die auf dem Philadelphia Chromosom basiert, können spezielle Wirkstoffe (Imatinib) gegeben werden, welche die Funktion von Abl1 eindämmen können und somit die unkontrollierte Teilung stoppen.

Es sind inzwischen weitere Fusionsgene bekannt, die Krebs verursachen und für die es passende Therapien gibt. Deshalb testet der PCDx Test auch diese Veränderungen, um den Tumor besser zu charakterisieren und dadurch die beste Therapie zu finden.


Tumormutationslast (TMB)

Bei der Bestimmung der Tumormutationslast wird die Anzahl von Mutationen bestimmt für eine definierte Menge an kodierendem Genom (Mutationen pro 1.000.000 DNA-Basenpaaren). Hier werden nur die Mutationen gezählt, die zu einer Veränderung auf der Proteinebene führen. Aktuelle Forschung hat gezeigt, dass die Tumormutationslast als Indikator verwendet werden kann, um vorherzusagen, ob eine bestimmt Klasse an zielgerichteten Medikamenten gegen Krebs einen Effekt gegen den speziellen Tumor besitzt. Diese Klasse an Medikamenten sind die Immun-Checkpoint-Inhibitoren. Diese Medikamente stimulieren das Immunsystem Neoantigene zu erkennen und damit die Tumorzelle als diese zu erkennen und zu zerstören. Neoantigen bezeichnet das veränderte Protein, das aus der Mutation resultiert und sich dadurch von den Proteinen in gesunden Zellen unterscheidet.

Wegen der gezeigten Korrelation zwischen Tumormutationslast und Höhe und Wirkung von Immun-Checkpoint-Inhibitoren, detektiert der PCDx Test die Tumormutationslast mittels Next Generation Sequencing, um eine weitere Ebene der Therapie-Vorhersage zu schaffen.


Mikrosatelliteninstabilität (MSI)

In der DNA kommen kurze sich wiederholende (repetitive) Abschnitte vor, sogenannte Mikrosatelliten. Des weiteren sind in einer Zelle bestimmte Proteine vorhanden, die entstandene DNA-Schäden reparieren. Ein solcher DNA-Schaden kann sein, dass bei der Verdoppelung der DNA bei der Zellteilung falsche Basen in den neu hergestellten DNA-Strang eingebaut werden („mismatch“). Wenn nun solche Reparatur-Proteine selbst durch eine Mutation defekt sind, führt dies neben weiteren Mutationen in neu gebildeter DNA auch zu neuen Abschnitten in den Mikrosatelliten. Dadurch kommt es zu einer Längenveränderung der Mikrosatelliten. Über den Nachweis einer Mikrosatelliteninstabilität kann man dann indirekt auf einen Defekt im DNA-Reparatursystem der Zelle schließen. Da es eine Korrelation gibt zwischen dem Vorliegen einer Mikrosatelliteninstabilität und dem Ansprechen auf Immuntherapien, testet der PCDx Test auch auf Mikrosatelliteninstabilität.


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Feb 25, 2020 By Dr. Julia Reiser

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